Supresión de la inflamación local mediante galectina.

Ingeniería Biomédica de la Naturaleza (2023)Citar este artículo

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El tratamiento de la inflamación crónica con tratamientos antiinflamatorios administrados por vía sistémica se asocia con efectos secundarios de moderados a graves y la eficacia de los fármacos administrados localmente es de corta duración. Aquí mostramos que la inflamación puede suprimirse localmente mediante una proteína de fusión de la enzima inmunosupresora indoleamina 2,3-dioxigenasa 1 (IDO) y galectina-3 (Gal3). Gal3 ancla IDO al tejido, limitando la difusión de IDO-Gal3 fuera del lugar de la inyección. En modelos de roedores de inflamación inducida por endotoxinas, psoriasis, enfermedad periodontal y osteoartritis, la proteína de fusión permaneció en los tejidos y articulaciones inflamados durante aproximadamente 1 semana después de la inyección, y la mejora de la inflamación local, la progresión de la enfermedad y el dolor inflamatorio en los animales fueron concomitantes. con preservación homeostática de los tejidos y con ausencia de supresión inmune global. IDO-Gal3 puede servir como enzima inmunomoduladora para el control de la inflamación focal en otras afecciones inflamatorias.

La inflamación crónica, caracterizada por interacciones entre células inmunitarias profesionales y células de los tejidos residentes, daña irreversiblemente los tejidos del cuerpo y es un factor de riesgo asociado para una serie de enfermedades como las cardiovasculares, la diabetes y el cáncer1,2. Un desafío importante en el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas es el desarrollo de terapias para dirigir de manera segura y específica la resolución de la inflamación en un sitio específico1. Los fármacos antiinflamatorios como los glucocorticoides son pleiotrópicos y afectan de forma no específica a numerosas vías1 y, en consecuencia, van acompañados de problemas de toxicidad, resistencia y una amplia gama de efectos adversos graves, como infección y cicatrización defectuosa de las heridas3. Además, la modulación inmune sistémica conduce a estados patológicos como hipertensión, osteoporosis, obesidad, cataratas y diabetes3. Los fármacos inmunosupresores biológicos que funcionan mediante el bloqueo de citocinas, el agotamiento celular o el bloqueo de los receptores de la superficie celular proporcionan una especificidad mejorada y pueden modular eficazmente las respuestas inmunitarias para detener la progresión de la enfermedad en ciertos pacientes, pero no en todos4. Sin embargo, dichos tratamientos también pueden aumentar la susceptibilidad a las infecciones y alterar la homeostasis de los tejidos, lo que provoca cáncer, exacerbación de la insuficiencia cardíaca congestiva y eventos neurológicos, entre otras patologías4. Fundamentalmente, cada una de estas terapias requiere un uso continuo durante toda la vida y aún quedan por desarrollarse opciones clínicas para resolver la inflamación crónica y restaurar la homeostasis del tejido5.

La capacidad de dirigir el metabolismo celular para programar respuestas inmunes ha surgido recientemente como una nueva vía para la inmunomodulación terapéutica6. El catabolismo del aminoácido esencial triptófano (Trp) por la enzima citosólica indoleamina 2,3-dioxigenasa 1 (IDO) y la producción resultante de metabolitos de quinurenina es un regulador general de la inflamación en respuesta a estímulos inflamatorios estériles y patógenos, actuando sobre ambos innatos. y células inmunes adaptativas7,8. El catabolismo IDO de Trp también es un factor que contribuye a promover la tolerancia fetal durante el embarazo, evitando la autoinmunidad y evitando la eliminación inmune en algunas formas de cáncer9. La insuficiencia de Trp a través de IDO activa el control general del sensor de estrés metabólico no reprimible 2 (GCN2) para regular el ciclo de las células inmunes10, mientras que los metabolitos de la vía de la quinurenina activan programas antiinflamatorios, como la unión de la quinurenina al receptor de arilhidrocarburo (AHR)11. Se ha demostrado que la expresión de IDO en células inmunes como macrófagos y células dendríticas suprime la activación y proliferación de células T al tiempo que activa y promueve el mantenimiento fenotípico de las células T reguladoras12,13,14. Además, el producto terminal de la vía de la quinurenina, la nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+), regula la función de inmunidad innata en los macrófagos durante el envejecimiento y la inflamación15. En total, las acciones de IDO sirven como un mecanismo clave para mantener la homeostasis, suprimir la autoinmunidad y detener el exceso de inflamación9,10. Informados por estos datos, imaginamos la administración terapéutica de IDO exógeno como un regulador de enfermedades inflamatorias crónicas.

Un obstáculo importante para el tratamiento de la inflamación tisular localizada sin inmunosupresión sistémica es la necesidad de acumular agentes terapéuticos en el sitio de acción previsto. Conceptualmente alineados con factores de crecimiento y anticuerpos diseñados para unirse a proteínas de la matriz extracelular para la retención tisular localizada16,17,18,19, recientemente demostramos la utilidad de enzimas modelo fusionadas a galectina-3 (Gal3), una proteína de unión a carbohidratos, como una proteína generalizable. significa restringir la difusión de enzimas mediante la unión a glicanos tisulares20. Gal3 se une a N-acetillactosamina y otros glicanos β-galactósidos, así como a glicosaminoglicanos, que son muy abundantes en los tejidos de los mamíferos21,22, y en conjunto representan un objetivo más universal que una proteína de matriz extracelular específica. Por lo tanto, la fusión de Gal3 con enzimas representa un enfoque prometedor para retener la función enzimática local en un sitio de acción previsto. Aprovechando este éxito, diseñamos la fusión IDO-Gal3 con la expectativa de crear un IDO anclado al tejido administrado como un tratamiento antiinflamatorio localizado (Fig. 1a, b). La eficacia se describe en cuatro situaciones inflamatorias distintas: inflamación inducida por endotoxinas, psoriasis, enfermedad periodontal y osteoartritis.

a, b, Representación esquemática de la proteína de fusión IDO-Gal3 (a) y el concepto de anclar IDO en diferentes ubicaciones de tejido mediante el reconocimiento de glicanos de tejido mediado por Gal3 (b). c, d, Caracterización de la actividad enzimática IDO-Gal3 (c), representada como tasa inicial (V0) frente a concentración de sustrato, donde la tasa inicial y máxima (Vmax) se expresan en unidades, U (pmol (n-formil quinurenina) min- 1 pmol-1(IDO)), y unión a lactosa inmovilizada (d). e, Programa para evaluar la supresión IDO anclada de la inflamación resultante de la inyección local de LPS. f,g, Evaluación histológica (f) de la supresión de la inflamación inducida por IDO-Gal3 mediante LPS inyectado mediante enumeración de la infiltración celular (g). Barra de escala, 50 micras. h – k, valores de cuantificación relativa (RQ) de la expresión del gen inflamatorio (IL-6, IFN-γ, IL-12, IL-1β) en tejidos tratados con IDO anclado antes de la exposición a LPS. l, m, programa (l) e índice de gravedad del área psoriásica (m) para evaluar la supresión anclada por IDO de la inflamación inducida por imiquimod tópico. La proteína que contiene Gal3, fusión de luciferasa NanoLuc® con Gal3 (NL-Gal3) y que carece del dominio IDO, se incluye como control. Los datos se muestran como media ± sem en c y media ± sd en g y m. Análisis estadístico: (g – k) análisis de varianza unidireccional (ANOVA) con post-hoc de Tukey. NS indica que no hay diferencias en comparación con el vehículo, ns indica que no hay diferencias en comparación con el control positivo de LPS, la barra indica el valor de P con respecto al control positivo de LPS; n = 6. Para g, P = 0,0054, F = 6,200. Para h, P = 0,0040, F = 6,630. Para i, P = 0,0006, F = 10,15. Para j, P = 0,0898, F = 2,579. Para m, prueba U de Mann-Whitney con alfa = 0,05, ****P < 0,0001, n = 12.

IDO-Gal3 catalizó la conversión de Trp en quinurenina (Fig. 1c) y se unió a la lactosa inmovilizada con una afinidad comparable a la de Gal3 de tipo salvaje (Fig. 1d). La inyección subcutánea (sc) de IDO-Gal3 previno la inflamación inducida por un desafío local de lipopolisacárido (LPS) mejor que IDO solo (Fig. 1e-k). El análisis histológico demostró que el tratamiento previo de 24 h con IDO-Gal3 mitigó la infiltración celular que sigue al desafío con LPS, mientras que el tratamiento previo con IDO no anclado no lo hizo (Fig. 1e-g). La infiltración celular de tejido naïve no se vio afectada por la inyección sc de IDO o IDO-Gal3, en comparación con el vehículo salino (PBS; Figura complementaria 1). El tratamiento previo con IDO-Gal3 bloqueó la transcripción de las citocinas proinflamatorias IL-6, IFN-γ e IL-12p35, mientras que la expresión fue mayor que en el control del vehículo después del tratamiento previo con IDO (Fig. 1h-j). Los niveles de transcripción de IL-1β variaron considerablemente después de la exposición a LPS, pero la tendencia sugirió que el tratamiento previo con IDO-Gal3 también suprimió la expresión de esta citocina proinflamatoria, mientras que el tratamiento previo con IDO no (Fig. 1k). La expresión génica de citoquinas inflamatorias en tejido naïve no cuestionada no se vio afectada por la inyección sc de IDO o IDO-Gal3, en comparación con el vehículo salino (PBS; Figura complementaria 2). Además, la administración sc de la proteína de control, la fusión NanoLuc con Gal3 (NL-Gal3), que carece del dominio IDO, tuvo poco o ningún efecto sobre la expresión génica del tejido ingenuo o desafiado por LPS (Figura complementaria 3). Esto sugirió que el dominio Gal3 no desempeñaba un papel inmunomodulador in vivo en la proteína de fusión IDO-Gal3. Una caracterización adicional in vitro fue consistente con la ausencia de inmunomodulación por parte del dominio de fusión Gal3, ya que la capacidad de IDO-Gal3 para suprimir la activación de LPS de células dendríticas cultivadas derivadas de médula ósea reflejó resultados anteriores con IDO de tipo salvaje solo, y el tratamiento con NL-Gal3 no lo hizo. no altera el fenotipo de las células dendríticas (Figura complementaria 4).

La inyección local de IDO-Gal3 también resolvió la inflamación en un modelo de psoriasis murina (Fig. 1l, m). La aplicación tópica diaria de imiquimod durante 14 días indujo inflamación, que alcanzó su punto máximo en el día 5, como lo refleja la puntuación clínica de gravedad de la psoriasis. La inyección del vehículo no afectó la puntuación de gravedad, que permaneció elevada durante los 14 días restantes. Por el contrario, la inyección subcutánea de IDO-Gal3 el día 3 condujo a una disminución dramática en la puntuación clínica el día 8, que se mantuvo baja durante todo el tiempo a pesar de la exposición diaria continua a imiquimod. Además, la administración de la proteína de fusión de control NL-Gal3 no demostró ningún efecto sobre la gravedad de la psoriasis (Fig. 1m), lo que corrobora la indicación de que el dominio Gal3 no desempeña un papel inmunomodulador en la respuesta terapéutica de IDO-Gal3. De acuerdo con esto, nuestro trabajo anterior20,23,24,25 muestra que la fusión de proteínas en el extremo N de Gal3, como NanoLuc, GFP o galectina-1, anula la actividad de señalización de Gal3, probablemente debido a su capacidad para formar proteínas de orden superior. Los oligómeros se inhiben mientras se mantiene la afinidad de unión a glucanos.

Dada la capacidad de la expresión del gen IDO celular endógeno (Ido1) para servir como retroalimentación positiva para elevar aún más la expresión9, las transcripciones endógenas de Ido1 se cuantificaron después del tratamiento con IDO-Gal3 tanto en el modelo LPS como en el de psoriasis (Figura complementaria 5). Si bien tanto la exposición a LPS como a imiquimod indujeron la expresión endógena de Ido1 como respuesta esperada a la inflamación, curiosamente, los tejidos tratados con IDO-Gal3 no lo hicieron, con niveles comparables a los valores iniciales. Estos datos sugieren que el suministro exógeno de IDO-Gal3 bloqueó la señalización inflamatoria y la inducción asociada de la expresión endógena de Ido1 en los tejidos locales; sin embargo, la expresión endógena de IDO de bajo nivel inducida por IDO-Gal3 en subconjuntos de células específicas (por ejemplo, células dendríticas locales o en tejido linfoide) también podría contribuir potencialmente a la resolución de la inflamación. En resumen, la administración sc de IDO-Gal3 mejoró la inflamación de la piel tanto de forma profiláctica como terapéutica, utilizando dos ataques inflamatorios diferentes que actúan a través de diferentes receptores específicos (CD14/TLR4 para LPS y TLR7 para imiquimod)26.

Recientemente demostramos que la fusión de Gal3 con varias enzimas confiere una afinidad de unión a glucanos que restringe la difusión de enzimas en los tejidos, prolongando la retención y localizando la catálisis enzimática20. Las imágenes in vivo detectaron IDO-Gal3 marcado con fluoróforo hasta 14 días en el sitio de inyección de sc hock (Figura complementaria 6a). Los niveles elevados de quinurenina en el tejido circundante detectados mediante análisis de espectrometría de masas fueron consistentes con la función enzimática IDO in vivo (Figura complementaria 6b). Además, las imágenes de bioluminiscencia de la enzima informadora anclada, la fusión de NanoLuc luciferasa y Gal3 (NL-Gal3), revelaron que se retenía en niveles altos en comparación con NanoLuc no anclada, y sugirieron que NL-Gal3 sc inyectado en el corvejón se restringía en gran medida a la inyección. sitio, aunque también se detectó una menor actividad enzimática en la región tibial adyacente, en el plasma y en las vías excretoras de la orina y las heces (Figura complementaria 7). Para determinar si la inmunosupresión sistémica inducida por IDO-Gal3 localizada (Figuras complementarias 6c-k), 120 h después de la inyección, los ratones se sometieron a una exposición a LPS en sitios ipsilaterales y contralaterales y, por separado, a una exposición oral a una infección por Listeria monocytogenes. La administración profiláctica de IDO-Gal3 en el corvejón ipsilateral bloqueó la infiltración de células inflamatorias inducida por LPS incluso 120 h después del pretratamiento, mientras que el infiltrado se elevó en el sitio de exposición a LPS contralateral, lo que sugiere que el bloqueo inflamatorio se localizó en el sitio ipsilateral (Fig. 6c,d). La administración de IDO-Gal3 en el sc hock no alteró el aclaramiento de L. monocytogenes en el hígado o el bazo en comparación con el control del vehículo (Figuras complementarias 6e-g), lo que indicó el mantenimiento de un sistema inmunológico que funciona globalmente al mismo tiempo que la supresión localizada en el tejido. . En corroboración con la reducción prolongada en los datos de infiltración celular a las 120 h después del tratamiento previo con IDO-Gal3 (Figuras complementarias 6c, d), la expresión de IL-6 e IL-1β en el sitio de exposición a LPS ipsilateral (Figuras complementarias 6h, i) fue suprimido; La expresión de IL-12p35, IL-12p40 e IFN-γ (Fig. 8 complementaria) también se suprimió, previniendo el aumento de la proteína IL-6 en plasma (Fig. 6j complementaria) y manteniendo los niveles basales de IL-1β en plasma (Fig. 6k complementaria) detectado en suero por espectrometría de masas. En conjunto, estas observaciones sugieren que IDO-Gal3 anclado al tejido indujo una potente supresión local de la inflamación sin suprimir globalmente la función inmune.

La enfermedad periodontal es una clase de enfermedades inflamatorias crónicas que no se resuelven y que resultan de la inflamación localizada de la mucosa y la activación de los osteoclastos, y que conducen a la destrucción del tejido blando (mucosa) y duro (hueso)27. Evaluada con un esquema de administración tanto profiláctico como terapéutico en un modelo de ratón con enfermedad periodontal polimicrobiana28,29 (Fig. 2a, b), la inyección submandibular de IDO-Gal3 se retuvo localmente, suprimió la inflamación de la mucosa y evitó la pérdida de hueso alveolar (Fig. 2c-l). ). Las imágenes in vivo del reportero anclado NL-Gal3 demostraron retención gingival durante 120 h (Fig. 2c, d), mientras que la localización del tejido para el NL no anclado no se pudo medir después de 36 h (Fig. 2d). El tiempo de retención no se vio alterado en presencia o ausencia de infección polimicrobiana (Fig. 2e). El resultado primario de la enfermedad periodontal, la pérdida de hueso mandibular, se cuantificó mediante análisis de microtomografía computarizada (micro-CT). Cuando se administró de forma profiláctica (IDO-Gal3-P), la inyección submandibular previno la pérdida ósea, y IDO-Gal3 inhibió una mayor pérdida ósea cuando se administró terapéuticamente (IDO-Gal3-T; Fig. 2f). Específicamente, la pérdida de volumen óseo trabecular (Fig. 2g) y espesor (Fig. 9 complementaria), junto con la pérdida ósea vertical (Fig. 2h), se previnieron mediante la administración profiláctica o terapéutica de IDO-Gal3. IDO-Gal3 también inhibió la inflamación gingival medida por los niveles de proteína de las citocinas IL-6 (Fig. 2i) e IL-1β (Fig. 2j), y la quimiocina MCP1 (Fig. 2k). Por el contrario, la producción de IL-10 se mantuvo en gran medida mediante el tratamiento con IDO-Gal3 (Fig. 2l), por lo que los niveles se acercaron más a los de los ratones no infectados, lo que sugiere un retorno al control homeostático. Se observó una disminución más pronunciada de la pérdida ósea y la supresión de la inflamación tras la administración terapéutica de IDO-Gal3 en comparación con la administración profiláctica (Fig. 2h-k), donde las citocinas inflamatorias IL-12p70, IP-10, KC-17, MIP -2 e IL-33 fueron los más afectados (Figura complementaria 10). IDO-Gal3 administrado a ratones no infectados (IDO-Gal3-U) tuvo un efecto insignificante sobre el hueso mandibular y la producción de citoquinas inflamatorias; sin embargo, se observaron niveles elevados de IL-10 y, en menor medida, MCP1 (Fig. 2j-l). Además, la administración de IDO-Gal3 no afectó la cantidad de Porphoromonas gingivalis o Aggregatibacter actinomycetemcomitans recuperada de la encía, independientemente del esquema de administración profiláctica o terapéutica (Figura 11 complementaria). En conjunto, estos datos indican que IDO-Gal3 aborda los requisitos terapéuticos clínicos para el tratamiento de la enfermedad periodontal: regulación localizada de la inflamación sin mejorar la acumulación bacteriana y prevención de la pérdida continua de hueso mandibular incluso después de que haya comenzado la progresión de la enfermedad.

a,b, La eficacia se investigó utilizando un modelo de ratón polimicrobiano de enfermedad periodontal y administración profiláctica (a) o terapéutica (b). c, d, la enzima indicadora de fusión anclada NanoLuc-Gal3 (NL-Gal3) inyectada submandibular se retuvo localmente durante 120 h, mediante imágenes in vivo (c), en contraste con NanoLuc no anclado que se difundió fuera del sitio de inyección (d, línea discontinua línea representa la línea base). e, el estado de infección no alteró el tiempo de retención submandibular de NL-Gal3; La línea de puntos representa la línea de base. f – h, Imágenes representativas del análisis micro-CT (f) que cuantifica el volumen óseo trabecular (g) y la pérdida ósea vertical (h), midiendo la unión amelocementaria. En f: barra de escala, 1,5 mm; el cuadro amarillo representa el retorno de la inversión estandarizado de 5,5 mm3, basado en 1,5 × 4,0 × 1,0 mm (vertical o cérvico-apical × horizontal o mesio-distal × lateral o vestibular-palatal); las líneas naranjas indican las distancias medidas entre la UCE y la cresta del hueso alveolar (n = 12). La inyección submandibular de IDO-Gal3 bloqueó la pérdida ósea mandibular en la administración profiláctica (IDO-Gal3-P) y detuvo la pérdida ósea mandibular en la administración terapéutica (IDO-Gal3-T). i – k, IDO-Gal3 redujo los niveles de proteína inflamatoria gingival de IL-6 (i), IL-1β (j) y MCP1 (k), con un efecto más pronunciado de la administración terapéutica (IDO-Gal3-T). l, IDO-Gal3 indujo la expresión de la proteína IL-10, restaurando niveles más cercanos a los del control no infectado (Uninfect). IDO-Gal3 administrado a ratones no infectados (IDO-Gal3-U) tuvo un efecto insignificante sobre el hueso mandibular y la producción de citocinas inflamatorias, al tiempo que aumentó los niveles de IL-10 y, en menor medida, MCP1. Los datos se muestran como media ± sem (d y e) y media ± sd (g – l). Análisis estadístico: (e) Prueba t de Student; norte = 5; (g – l) ANOVA unidireccional con la prueba post-hoc de Tukey, n = 5. Para (g), P <0,0001, F = 20,41. Para h, P < 0,0001, F = 75,53. Para i, P < 0,0001, F = 73,69. Para j, P < 0,0001, F = 44,24. Para k, P < 0,0001, F = 66,63. Para l, P < 0,0001, F = 122,8. Para g – l, a menos que se especifique lo contrario, los valores de P por pares del análisis post hoc de Tukey se informan como 'X, Y', donde X representa la comparación con 'Infectar' e Y representa la comparación con 'Desinfectar'; ****P < 0,0001.

La osteoartritis inflamatoria postraumática (PTOA), una forma de osteoartritis (OA), surge comúnmente después de un desgarro de ligamento o menisco, o después de una sobrecarga repetida de una articulación. Se utilizó un modelo de ratón PTOA con sobrecarga mecánica cíclica30,31 para probar la capacidad de IDO-Gal3 para reducir el daño articular inflamatorio inducido por la carga. La inyección intraarticular de IDO-Gal3 se retuvo localmente, suprimió la inflamación y evitó la destrucción del tejido articular (Fig. 3). Se aplicó una carga mecánica cíclica a las rodillas de ratones de edad avanzada (Fig. 3a y Fig. 12 complementaria), con daño mecánico y la consiguiente inflamación que resultó en inflamación sinovial y degradación del cartílago. En un estudio de retención, se administró IDO marcado con fluorescencia o IDO-Gal3 marcado después de 2 semanas de carga mecánica articular inicial. Las imágenes a las 24 h (Fig. 13 complementaria) y el día 7 después de la inyección revelaron que la retención de IDO-Gal3 marcada en la articulación fue significativamente mayor que la de IDO no anclada, visualizada en rodillas explantadas (Fig. 3b) y cuantificada (Fig. 3c). mediante análisis de imágenes ex vivo. El área bajo la curva farmacocinética (AUC), calculada a partir de imágenes intravitales diarias durante 7 días, fue aproximadamente 2 veces mayor para IDO-Gal3 que para IDO solo (Fig. 3d). La administración intraarticular semanal de IDO-Gal3 bloqueó la expresión genética de las citocinas inflamatorias IL-6 e IL-12p40 en el tejido articular combinado (pared sinovial y superficie articular; Fig. 3e, f) y ganglios linfáticos de drenaje (Fig. 3g, h). , mientras que IDO por sí sola no lo hizo. Por el contrario, la expresión ni de MMP13 ni de TNF-α se moduló en ninguna de las ubicaciones (Figura 14 complementaria). Fundamentalmente, IDO-Gal3 redujo los cambios histológicos inducidos por la carga, según la puntuación de un histopatólogo cegado al tratamiento utilizando tanto la puntuación de salud articular total (puntuación de enfermedad articular degenerativa (DJD)) (Fig. 3i, j) como la puntuación del cartílago articular (OARSI) ( Figura 3k,l). Muestras histológicas adicionales respaldan estas tendencias (Figuras complementarias 15 a 18; descripción de los criterios de puntuación proporcionada en las Figuras complementarias 19 y 20). En resumen, la fusión Gal3 proporcionó retención articular local, y IDO-Gal3 redujo potentemente la expresión de genes inflamatorios y los cambios estructurales inducidos por sobrecarga mecánica en la articulación.

a, Se utilizó un modelo de ratón PTOA con sobrecarga mecánica cíclica de 4 semanas en ratones tratados semanalmente con inyecciones intraarticulares de IDO-Gal3. b, c, Imágenes de fluorescencia de explante de rodilla que ilustran (b) y cuantifican (c) la retención del día 7 de IDO e IDO-Gal3 marcados fluorescentemente administrados después de 2 semanas de carga mecánica. d, análisis farmacocinético del AUC a partir de imágenes fluorescentes diarias durante 7 días. e – h, la expresión génica de las citocinas IL-6 e IL-12p40 se midió mediante PCR cuantitativa en tejido articular combinado de la pared sinovial y la superficie articular (e, f) y ganglios linfáticos de drenaje (g, h). i, j, histología articular teñida con H&E en las rodillas que destaca la inflamación y el engrosamiento sinovial (i) y la puntuación DJD de la progresión de la enfermedad articular (j). k, l, tinción histológica con safranina O que resalta los cambios estructurales y el contenido de proteoglicanos del cartílago articular (k) y puntuación OARSI de la estructura del cartílago (l). Los datos en j y l se muestran como media ± IC del 95 % Análisis estadístico: (c,d) Prueba t de Student, n = 6. Para e–h: ANOVA unidireccional con prueba post-hoc de Tukey; n = 6. Para e, P = 0,0035, F = 6,303. Para f, P < 0,0001, F = 12,92, ****P < 0,0001. Para g, P = 0,0128, F = 4,639. Para h, P = 0,0069, F = 5,403. Para j y l, Brown-Forsythe y Welch ANOVA; n = 6. Para j, P = 0,0325, F* = 4,173. Para l, P = 0,0012, F* = 6,083. Valores de p informados para grupos estadísticamente diferentes; todos los demás grupos, NS.

Observamos que las inyecciones múltiples de IDO-Gal3 humano en ratones provocaron la aparición de algunos anticuerpos anti-IDO-Gal3 (Figura complementaria 21), lo cual no es irrazonable dada la falta de coincidencia del huésped; sin embargo, estos anticuerpos no surgieron hasta después de aproximadamente 3 inyecciones y no disminuyeron la eficacia en los modelos de inyección múltiple (osteoartritis y enfermedad periodontal) en comparación con los modelos de inyección única (inflamación por LPS y psoriasis).

El dolor y la discapacidad de la osteoartritis se asocian con inflamación crónica en una articulación irreparablemente dañada32. Para investigar un tratamiento de dosis única de IDO-Gal3 en OA establecida, se utilizó un modelo de rata PTOA inducido quirúrgicamente, donde la OA desarrolló durante 8 semanas de daño articular acumulado después de la sección del ligamento colateral medial y el menisco medial (MCLT + MMT)33. 34. La inyección intraarticular de IDO-Gal3 se retuvo localmente, suprimió la inflamación de las articulaciones, redujo el dolor asociado a la OA y mejoró la marcha de las ratas (Fig. 4). Administrado tanto en OA como en articulaciones sanas contralaterales (Fig. 4a), la luminiscencia del informador anclado NL-Gal3 se pudo medir durante varios días después de la inyección, mientras que no se encontró NL no anclado en la articulación después de 1 día (Fig. 4c). Los tiempos de residencia conjunta (95% de decadencia) para NL-Gal3 fueron 2 días en articulaciones OA y 1,3 días en articulaciones sanas, lo que es hasta 4 veces más largo en comparación con 0,5 días para NL tanto en articulaciones OA como sanas (Fig. 4c derecha). ). La inyección de IDO-Gal3 a las 8 semanas después de la cirugía (Fig. 4b) bloqueó la producción local de citocinas inflamatorias y, además, revirtió la sensibilidad táctil y la marcha compensatoria asociadas a la OA (Fig. 4d-g). El tratamiento con IDO-Gal3 redujo la producción de proteínas de la citoquina inflamatoria IL-6 en las articulaciones OA a niveles encontrados en articulaciones sanas (Fig. 4d). Además, los niveles locales de quimiocina inflamatoria MCP1 siguieron esta misma tendencia (P = 0,09; Fig. 4e). La sensibilidad táctil como métrica del dolor asociado a la OA se cuantificó durante 3 semanas utilizando monofilamentos de von Frey (Figura complementaria 22, valores absolutos). Representado como el cambio en el umbral de retirada de la pata (después de la inyección - preinyección), el tratamiento con IDO-Gal3 revirtió la hipersensibilidad de las extremidades en el día 8 después de la inyección, persistiendo hasta el día 23, lo que representa una mejora del doble, mientras que la inyección de vehículo salino proporcionó sólo una mejora marginal (Fig. 4f). La marcha de los roedores se evaluó mediante videografía de alta velocidad y grabaciones simultáneas de placas de fuerza35. Las ratas tratadas con IDO-Gal3 utilizaron velocidades de caminata más rápidas el día 16 después de la inyección y tendieron a caminar más rápido el día 23 después de la inyección (Figuras complementarias 23a, b). En particular, la fuerza vertical máxima representada en función de la velocidad demostró que una sola inyección de IDO-Gal3 corrigió la distribución desequilibrada del peso en animales afectados por OA, donde la carga dinámica en las extremidades tratadas con IDO-Gal3 fue indistinguible de la de los controles contralaterales sanos durante todo el estudio. duración (Fig. 4g fila superior y Fig. complementaria 23c). Esto contrastó con el claro desequilibrio de carga entre las extremidades tratadas con solución salina y las contralaterales (Fig. 4g, fila inferior y Fig. complementaria 23c). En particular, los tratamientos con IDO-Gal3 y solución salina fueron sustancialmente diferentes en los días 9, 16 y 24 posteriores a la inyección. En conjunto, estos datos indican una potente mejora de la inflamación de la OA establecida, junto con una mejora concomitante de los síntomas de la OA.

a, Después de un desgarro de menisco simulado quirúrgicamente en la rata, se evaluó la eliminación de NL-Gal3 8 semanas después del daño articular acumulado. b. Utilizando el mismo modelo y diseño experimental, se evaluaron los efectos de IDO-Gal3 sobre la inflamación y los síntomas asociados a la OA. c, Las imágenes de luminiscencia (izquierda) demostraron que NL-Gal3 se retiene en las articulaciones sanas y afectadas por OA durante más tiempo que la NL no conjugada, con tiempos significativamente más largos hasta un 95 % de deterioro (derecha) en las rodillas inyectadas con NL-Gal3. d, A los 28 días después de las inyecciones en las articulaciones afectadas por OA, las rodillas tratadas con solución salina tenían niveles elevados de IL-6 (P = 0,0021, t = 3,4689, df = 23,3), mientras que los niveles de IDO-Gal3 eran comparables a los de las rodillas contralaterales sanas. e, Los niveles intraarticulares de MCP1 (es decir, CCL2) siguieron un perfil similar, pero CCL2 no se elevó significativamente en las rodillas tratadas con solución salina para este estudio (P = 0,09, F = 3,41, (df, df) = (1 , 24)). f, En comparación con los animales tratados con solución salina, los animales tratados con IDO-Gal3 tuvieron mejoras en los niveles de sensibilidad táctil a lo largo del tiempo. Los datos sin procesar se muestran en la figura complementaria 22. g, los animales tratados con IDO-Gal3 tuvieron una distribución de peso similar entre la extremidad afectada por OA y la contralateral, mientras que los animales tratados con solución salina tuvieron una descarga significativa de la extremidad afectada por OA. Los datos sin procesar se muestran en la figura complementaria 23. n = 6 para vehículo OA y control saludable en d y e; n = 7 para OA-IDO-G3 y su control saludable en d y e; norte = 7 para f. En d – f, los datos se presentan como media ± IC del 95 %. Los datos en d y e se analizaron con un modelo lineal de efectos mixtos, tratando la extremidad y el grupo de tratamiento como factores fijos y el animal como un efecto aleatorio. Si lo indica un ANOVA sobre los efectos fijos, las comparaciones múltiples de estimaciones de medias de mínimos cuadrados se corrigieron para errores compuestos de tipo 1 mediante una corrección HSD de Tukey. Los datos en f se analizaron con un ANOVA de medidas repetidas con ajuste HSD post-hoc de Tukey para errores compuestos de tipo 1. En f: *P = 0,0244, F = 6,8883, (gl, gl) = (1, 11). Las diferencias específicas entre las rodillas tratadas con IDO-G3 y las tratadas con vehículo en cada semana son las siguientes: Semana 9: P = 0,013, t = 2,61, gl = 41; Semana 10: P = 0,004, t = 3,07, gl = 41; y Semana 11: P = 0,041, t = 2,11, gl = 41. En g: las bandas de error representan el IC del 95 % de la media poblacional; Los datos de comportamiento se evaluaron utilizando un modelo lineal de efectos mixtos que trata los identificadores de animales como un efecto aleatorio a lo largo del tiempo. En g columna 2, el tratado con vehículo difirió de su control contralateral (P = 0,002, t = 3,099, df = 774) y el tratado con IDO-G3 difirió del tratado con vehículo (P = 0,007, t = 2,73, df = 260) ; en la columna 3, los tratados con IDO-G3 diferían de los tratados con vehículo (P = 0,008, t = 2,72, gl = 131); y en la columna 4, el tratado con vehículo difirió de su control contralateral (P = 0,004, t = 2,88, gl = 773) y el tratado con IDO-G3 difirió del tratado con vehículo (P = 0,016, t = 2,42, gl = 225) .

En resumen, la fusión de enzimas ancladas en tejido IDO-Gal3 representa una nueva clase de proteína terapéutica antiinflamatoria con amplias implicaciones potenciales para mejores resultados del tratamiento y efectos secundarios sistémicos reducidos para una amplia variedad de enfermedades inflamatorias localizadas. La enzima inmunomoduladora citosólica IDO se concibió como una proteína terapéutica que funciona exógenamente y se puede administrar localmente para manipular directamente el metabolismo del aminoácido esencial triptófano, actuando aquí como un profármaco disponible sistémicamente. La fusión con Gal3 prolongó la localización y retención de la enzima mediante la unión a glicanos, que se expresan de forma ubicua en los tejidos de los mamíferos. La conservación de glicanos entre especies permite la traducción sin necesidad de rediseño para objetivos específicos de humanos. La administración de IDO-Gal3 controló de forma sólida la inflamación local en cuatro entornos inflamatorios distintos en múltiples especies y en múltiples entornos tisulares. El tratamiento restableció la homeostasis, preservó la integridad y función del tejido y alivió el dolor asociado a la inflamación. La administración de IDO-Gal3 bloqueó uniformemente la IL-6 en cada modelo inflamatorio investigado, entre muchas otras citocinas y quimiocinas, y no indujo inmunosupresión sistémica. En conjunto, este trabajo destaca cómo la enzima anclada a galectina supera el obstáculo de la difusión de un fármaco lejos del sitio de acción previsto y señala a IDO-Gal3 como un fármaco antiinflamatorio.

NanoLuc es el nombre comercial de una variante de luciferasa de camarón de aguas profundas desarrollada por Promega Corporation36. Se insertaron genes que codifican proteínas de fusión en vectores pET-21d(+) entre los sitios NcoI y XhoI. Las secuencias genéticas y proteicas de IDO-Gal3 se proporcionan en Información complementaria. Los plásmidos confieren resistencia a la ampicilina y se transformaron primero en E. coli químicamente competente One Shot TOP10 (ThermoFisher), se seleccionaron en agar ampicilina Luria-Bertani (LB) (50 μg ml-1) y se incubaron durante la noche a 37 °C. Las colonias aisladas de las placas se subcultivaron en 5 ml de caldo de ampicilina LB durante la noche a 37 °C con agitación orbital. Los transformantes exitosos fueron confirmados mediante secuenciación de Sanger (Genewiz). Luego, las secuencias de ADN positivas se transformaron en la cepa de expresión resistente a kanamicina B, Origami B (DE3) E. coli (Novagen) y se seleccionaron en agar ampicilina LB con kanamicina B (15 μg ml-1). Se recogieron los clones positivos, se almacenaron en LB con 10% p/v de glicerol y se usaron para precultivar 5 ml de ampicilina y kanamicina de LB. Se utilizaron precultivos nocturnos para inocular 1 l de medio TY 2 × (16 g de triptona, 10 g de extracto de levadura, 5 g de NaCl) con ampicilina y kanamicina B a 37 °C y 225 rpm en un agitador orbital hasta una fase de crecimiento exponencial aproximada (densidad óptica ( DO)600 nm = 0,6–0,8). Los cultivos de expresión de IDO-Gal3 se complementaron con ácido δ-aminolevulínico 500 μM (Sigma) en el momento de la inoculación. La expresión de proteínas recombinantes se desencadenó utilizando isopropil β-d-1-tiogalactopiranósido 0,5 mM (ThermoFisher) y se incubó durante 18 h en un agitador orbital a 18 °C. Las bacterias se lavaron y sedimentaron con PBS mediante centrifugación (13.180 x g a 4 ° C durante 10 min) con una centrífuga de alta velocidad (ThermoFisher). Posteriormente, el sedimento se pesó, se resuspendió en 4 ml de PBS por gramo de sedimento con inhibidor de proteasa (ThermoFisher) y se rompió mediante desmembración sónica (15 s encendido, 45 s apagado, 10 min de tiempo de ciclo; ThermoFisher). Después de la desmembración, los lisados ​​se trataron con 20 unidades por gramo de ADNasa I (ThermoFisher) y 800 μg g-1 de lisozima (ThermoFisher). El lisado se centrifugó (38.360 x ga 4 ° C durante 15 min) para eliminar la fracción insoluble y el sobrenadante se recogió por decantación. El sobrenadante que contenía proteína recombinante soluble se cargó en una columna de afinidad de α-lactosa agarosa (Sigma) preequilibrada con PBS. Las columnas se lavaron con 20 volúmenes de columna de PBS y las proteínas recombinantes se eluyeron con β-d-lactosa 100 mM (Sigma) preparada en PBS. Se realizó un paso de pulido final mediante cromatografía de exclusión por tamaño de 200 kDa en el sistema de cromatografía pura AKTA (GE Life Sciences) para eliminar la α-lactosa y aislar aún más IDO-Gal3. La pureza de la proteína se determinó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) y tinción de Coomassie. Los contaminantes de endotoxinas se eliminaron mediante una solución de eliminación de endotoxinas (Sigma) siguiendo las instrucciones del fabricante. El contenido de endotoxinas se analizó mediante el ensayo de cuantificación de endotoxinas cromogénicas cinéticas Chromo-LAL (Associates of Cape Cod) y se determinó que estaba por debajo de 0,1 UE ml-1 en todas las reservas.

La IDO humana recombinante expresada en E. coli se adquirió de R&D Systems (masa molecular prevista de 46 kDa, una actividad específica de >500 pmol min-1 μg-1 (o para cálculos equimolares >29 pmol NFK min-1 pmol-1 IDO ) medida por su capacidad para oxidar l-triptófano a N-formil-quinurenina (NFK)). La actividad específica de ambas proteínas, IDO e IDO-Gal3, se midió antes de los experimentos para garantizar el máximo efecto al comienzo del ensayo, siguiendo el protocolo del fabricante de IDO. IDO-Gal3 se hizo reaccionar en cantidades equimolares con IDO en el protocolo estándar, y las actividades se compararon utilizando la unidad pmol NFK min-1 pmol-1 IDO para comparar la actividad con mayor precisión.

La afinidad de IDO-Gal3 por la lactosa se determinó mediante cromatografía de afinidad en un sistema de cromatografía AKTA Pure (GE Life Sciences) equipado con una columna de vidrio empacable para el consumidor (GE Life Sciences) empaquetada con resina de afinidad de agarosa α-lactosa (Sigma-Aldrich). Las proteínas se eluyeron con un gradiente lineal de β-lactosa (Sigma-Aldrich) en tampón fosfato.

La secuencia utilizada fue , con los sitios de restricción subrayados.

MAHAMENSWTISKEYHIDEEVGFALPNPQENLPDFYNDWMFIAKHLPDLIESGQLRERVEKLNMLSIDHLTDHKSQRLARLVLGCITMAYVWGKGHGDVRKVLPRNIAVPYCQLSKKLELPPILVYADCVLANWKKKDPNKPLTYENMDVLFSFRDGDCSKGFFLVSLLVEIAAASAIKVIPTVFKAMQMQERDTLLKALLEIASCLEKALQVFHQIHDHVNPKAFFSVLRIYLSGWKGNPQLSDGLVYEGFWEDPKEFAGGSAGQSSVFQCFDVLLGIQQTAGGGHAAQFLQDMRRYMPPAHRNFLCSLESNPSVREFVLSKGDAGLREAYDACVKALVSLRSYHLQIVTKYILIPASQQPKENKTSEDPSKLEAKGTGGTDLMNFLKTVRSTTEKSLLKEGGSGGGSGGSGGSGGEFADNFSLHDALSGSGNPNPQGWPGAWGNQPAGAGGYPGASYPGAYPGQAPPGAYPGQAPPGAYPGAPGAYPGAPAPGVYPGPPSGPGAYPSSGQPSAPGAYPATGPYGAPAGPLIVPYNLPLPGGVVPRMLITILGTVKPNANRIALDFQRGNDVAFHFNPRFNENNRRVIVCNTKLDNNWGREERQSVFPFESGKPFKIQVLVEPDHFKVAVNDAHLLQYNHRVKKLNEISKLGISGDIDLTSASYNMILEHHHHHH

A los ratones B6 se les administraron 2,1 μg de IDO-Gal3 en 40 μl de PBS por vía subcutánea (ipsilateral y contralateral) en la región del corvejón y se les expuso a 2 ng g-1 de lipopolisacárido (LPS) en 40 μl, después de 24 h o 120 h después de IDO- Tratamiento con Gal3, para evaluar la modulación local y distal de la inflamación. 2 h después de la administración de LPS, los animales fueron sacrificados y se recogió el lugar de la inyección.

El tejido blando se separó del hueso y se almacenó en el reactivo de estabilización de ARN RNAlater (Qiagen) en preparación para qPCR. Los tejidos blandos se homogeneizaron y el ARN se purificó utilizando el mini kit RNeasy Protect (Qiagen). El ADN complementario se sintetizó a partir de ARN utilizando el kit de transcriptasa inversa de ADNc de alta capacidad (ThermoFisher) para su uso en qPCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El análisis de qPCR se realizó con cebadores específicos para citocinas proinflamatorias (IL-12a, IL-12b, IL-1β, IFN-γ e IL-6) utilizando el sistema de PCR en tiempo real QuantStudio 12K Flex de Applied Biosystems. Los resultados se presentan como la relación entre la expresión génica y la expresión de gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) determinada mediante el método de cuantificación relativa. Los grupos de tratamiento se normalizaron al grupo de PBS únicamente.

Los ratones se alojaron en jaulas ventiladas individualmente con ropa de cama de mazorcas de maíz, se les proporcionó agua de ósmosis inversa y dieta estándar, ciclo de luz: oscuridad de 14 h: 10 h, temperatura ambiente de 68 a 79 ℉ y humedad relativa de 30 a 70 %.

Los tejidos se fijaron con formalina neutra al 10% (pH 7,4) durante la noche. Después de la fijación, los tejidos se lavaron en agua desionizada y se descalcificaron almacenándolos en ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) al 10% a 4 °C durante 3 semanas. Las muestras se evaluaron cada 2 a 3 días para determinar su rigidez y se repuso la solución de EDTA. Los tejidos se enviaron en etanol al 70% al Núcleo de Patología Molecular de la Universidad de Florida para su procesamiento, inclusión en parafina, corte, montaje y tinción con hematoxilina y eosina (H&E). Se tomaron imágenes de los tejidos utilizando un Zeiss Axiovert 200M con un objetivo de ×20 a través del módulo de adquisición multidimensional. Se tomaron once imágenes por tejido y dos individuos independientes cegados las calificaron según la infiltración celular (0: ausente, 1: leve, 2: moderada, 3: grave) y la hipertrofia de la epidermis (0: 0–20 μm de espesor, 1 : 21–40 μm, 2: 41–60 μm, 3: 61 μm o superior).

Se inyectó IDO-Gal3 (2,2 μg) en 40 μl de PBS o 40 μl de PBS solo en el sitio del corvejón de ratones B6 (n = 3). 30 minutos después de la inyección, los ratones fueron sacrificados, las regiones del tejido del corvejón y la tibia se extirparon y se congelaron instantáneamente usando nitrógeno líquido. Luego, estas muestras se enviaron al Centro Sudeste de Metabolómica Integrada de la Universidad de Florida para el análisis espectrométrico de masas de los niveles de quinurenina.

Según los criterios de valoración prescritos, los animales se colocaron bajo anestesia terminal profunda y se realizaron punciones cardíacas. Se recogió sangre (2 ml) en tubos separadores de suero microtainer y se centrifugó a 1.500 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente. El suero se recogió y almacenó a -20 °C. El análisis de citocinas se realizó utilizando un sistema Luminex 200 que ejecuta el software xPONENT 3.1 (Luminex) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Se llevó a cabo un modelado preclínico de psoriasis en ratones hembra C57BL/6j de 8 a 12 semanas de edad (Jackson Laboratory) de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Florida. El modelo utilizado fue una versión modificada de un modelo previamente informado37. Brevemente, se anestesiaron a los ratones y se les afeitó la espalda, seguido de la aplicación de crema depilatoria para eliminar cualquier resto de pelo. Cada día durante 14 días en total, se aplicó crema IMQ al 5% (62,5 mg, Patterson Veterinary Supply, 07-893-7787) en la espalda de los ratones. El tercer día de la aplicación de IMQ, a los ratones se les inyectaron por vía subcutánea cinco dosis de 10 μg de IDO-Gal3 en solución salina estéril distribuidas uniformemente por toda la espalda, un equivalente molar de NL-Gal3 administrado en el mismo volumen o un control de solución salina estéril (n = 12 por grupo). La gravedad de la enfermedad se midió cada día utilizando una versión modificada del Índice de gravedad y área de psoriasis (PASI), donde no se tiene en cuenta el área de efecto. El eritema (enrojecimiento), la descamación y el engrosamiento se calificaron de forma independiente y se les asignó una puntuación en una escala de 0 a 4: 0, ninguno, 1: leve, 2: moderado, 3: marcado, 4: muy marcado. La puntuación acumulada se informó como una medida de la gravedad de la inflamación (escala de 0 a 12).

Se realizaron imágenes in vivo de IDO-Gal3 marcado con fluorescencia en ratones hembra C57BL/6j de 8 a 12 semanas de edad (Laboratorio Jackson) de acuerdo con el IACUC de la Universidad de Florida. Antes de la inyección, se incubó IDO-Gal3 con IRDye 680RD NHS Ester (LI-COR, 929-70050) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los ratones recibieron una inyección subcutánea de 40 µl (2,1 µg, 3,27 µM) de IDO-Gal3 marcado con fluorescencia en el corvejón. Inmediatamente después de la inyección y cada 24 h posteriores a la inyección, se tomaron imágenes de los ratones utilizando un sistema de imágenes in vivo IVIS Spectrum (PerkinElmer). Las imágenes fluorescentes se capturaron utilizando el filtro de emisión AF680, tamaño del sujeto 1,5 cm, tiempo de exposición de 0,2 s, campo de visión B (6,6 cm), resolución de agrupamiento medio (factor de 8) y apertura de 1F/Stop. Las intensidades fluorescentes relativas se representaron mediante una escala de pseudocolor que iba del rojo (menos intenso) al amarillo (más intenso).

Se inyectó por vía subcutánea NanoLuc-Gal3 (164 pmol) en 40 µl de PBS en el corvejón de ratones B6. En los momentos prescritos, los animales fueron sacrificados de acuerdo con los protocolos aprobados. Se recogieron, pesaron, procesaron, incubaron con furimacina y se cuantificó la bioluminiscencia mediante un luminómetro los órganos y tejidos de interés. Las imágenes de bioluminiscencia se adquirieron utilizando un sistema de imágenes in vivo IVIS Spectrum. Se utilizó el software Living Image v4.3.1 (PerkinElmer) para adquirir los datos inmediatamente después de la administración de furimazina. El tiempo de exposición para las imágenes de bioluminiscencia fue de 1 s. Las regiones de interés (ROI) se cuantificaron como la radiancia promedio (fotones s-1 cm-2 sr-1). La cantidad específica de proteína en el tejido se determinó comparándola con una curva estándar de actividad NanoLuc-Gal3.

Se evaluó la supresión inmune de IDO-Gal3 en respuesta a la infección oral con Listeria monocytogenes InIAM (cepa 10403s). Las cargas de bacterias tisulares en el hígado y el bazo se utilizaron como métrica para la infección, donde el hígado es local para la infección intestinal y el bazo representa la propagación sistémica de la infección. El día antes de la infección, ratones C57BL/6 sin tratamiento previo de 10 semanas (Taconic Biosciences) recibieron una inyección de IDO-Gal3 por vía subcutánea (corvejón), mientras que los ratones de control recibieron una inyección de solución salina estéril. Al día siguiente, los ratones se infectaron por vía oral con 2 × 109 unidades formadoras de colonias (ufc) de Listeria monocytogenes por ratón. Para prepararse para la infección, las bacterias se cultivaron durante la noche en caldo BHI a 37 °C, agitando a 220 rpm. Antes de la infección, se cultivó un subcultivo de 2 ml de bacterias y 18 ml de caldo BHI en las mismas condiciones hasta alcanzar una DO600 = 0,8. Las bacterias se sedimentaron, se resuspendieron en 500 µl de PBS estéril y se pipetearon 50 µl de bacterias en un pequeño cuadrado de pan blanco y se alimentaron a cada ratón individualmente. Una vez que se comió todo el trozo de pan, los ratones fueron devueltos a su jaula. El día 7 después de la infección, los ratones fueron sacrificados, seguido de la recolección del bazo y el hígado. El tejido se homogeneizó, se suspendió en saponina al 1% durante 1 h y luego se sembró en diluciones en serie desde sin diluir hasta 1:1000. Las placas de BHI Agar se trataron con estreptomicina para limitar el crecimiento bacteriano no específico, ya que esta cepa de L. monocytogenes es resistente a la estreptomicina. Las UFC se contaron a las 24 h después de la siembra.

Todos los ratones se lavaron con 25 µl de gluconato de clorhexidina al 0,12% (3 M) durante 3 días. Los días 4, 5, 6 y 7, los ratones recibieron un lavado oral de 25 μl con 2,5 × 109 P. gingivalis cepa 381 y 2,5 × 109 Aggregatibacter actinomycetemocomitans cepa 29522 (ATCC) resuspendidos en carboximetilcelulosa de baja viscosidad al 2% ( Sigma-Aldrich). El lavado oral se repitió cada semana durante 5 semanas. Cada semana, 1 día antes del primer día de infección (profiláctico) o 1 día después del último día de infección (terapéutico), se inyectaron 10 µl de IDO-Gal3 en el espacio submandibular utilizando una jeringa de insulina de calibre 30 (Becton Dickenson). . Cada semana de infección, el primer día de la infección, antes de la infección, se realizó una muestra microbiana del entorno bucal con hisopos de alginato de calcio (ThermoFisher). Una semana después de la última infección, se recogieron las mandíbulas para evaluar la expresión del mediador soluble en tejidos blandos y el análisis morfométrico óseo.

Las mandíbulas con tejido blando y hueso se sometieron a golpes de perlas en dos intervalos de 2 minutos con 2 minutos de enfriamiento entre ellas utilizando perlas de sílice de circonio de 1,0 mm de diámetro (BioSpec) en tampón de extracción celular (ThermoFisher). El tampón se preparó con un cóctel de inhibidor de proteasa (mini cOmplete, Roche) y un inhibidor de proteasa PMSF (Abcam) para permitir la disociación y lisis de todo el tejido blando dejando intactos los tejidos duros. Se utilizaron ensayos MILLIPLEX Multiplex (EMD Millipore) para sondear los lisados ​​resultantes en busca de IL-6, IL-1β, IL-10 y MCP1 según los protocolos del fabricante. Los datos se adquirieron en un sistema Luminex 200 con el software xPONENT 3.1 (Luminex) y se analizaron utilizando un método de ajuste de curva spline logística de 5 parámetros utilizando el software Milliplex Analyst v5.1 (Vigene Tech). Los datos se presentan como pg ml-1 normalizados a proteína total (ensayo BCA; ThermoFisher Pierce).

Las mandíbulas se fijaron en formalina tamponada al 4% durante 24 h, se almacenaron en alcohol al 70% y se escanearon con una resolución de 18 μm utilizando un sistema micro-CT (Skyscan). Se reconstruyeron imágenes tridimensionales y las imágenes resultantes se reorientaron espacialmente utilizando puntos de referencia anatómicos con el software NRecon y DataViewer (Skyscan). Se configuró un retorno de inversión estandarizado de 5,4 mm3 con dimensiones estandarizadas de 1,5 (frontal) × 4,0 (sagital) × 0,9 mm (transversal). Se utilizaron puntos de referencia anatómicos para el posicionamiento estandarizado de la ROI: plano frontal, el techo del área de furcación entre las raíces mesial y distal del primer molar superior; En el plano sagital, el límite anterior era la cara distal de la raíz mesial del primer molar. El espesor de la ROI en el plano transversal se estableció en 50 cortes (900 μm) y se contó hacia la dirección palatina/medial a partir de la imagen que incluía el centro del primer molar superior en su ancho transversal. Se estableció un umbral estandarizado para distinguir entre tejidos no mineralizados y mineralizados donde se calcularon el volumen total y el espesor total del ROI. El análisis del volumen medio del hueso trabecular (BV) y del espesor (BT) evaluó el porcentaje de tejido mineralizado (BV; BT) dentro del volumen/espesor total (TV; TT) del ROI y se presenta como la relación BV/TV (media trabecular). volumen óseo) o relación BT/TT (grosor trabecular medio). La pérdida ósea vertical es la distancia desde la unión amelocementaria (CEJ) hasta el hueso alveolar y se calculó en 12 sitios en tres molares y se promedió para calcular la pérdida ósea vertical promedio en mm.

El ADN genómico se aisló a partir de muestras microbianas del entorno bucal utilizando un kit DNeasy (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Luego se sondeó el ADNg para detectar P. gingivalis 16S, A. actinomycetemocomitans 16S y 16S total mediante PCR en tiempo real. El porcentaje de A. actinomycetemocomitans 16S y P. gingivalis 16S dentro del compartimento 16S total se calculó utilizando la siguiente fórmula: Valor Ct del 16S total/valor Ct de A. actinomycetemocomitans o P. gingivalis 16S. ARNr 16s para: AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG; Rev: ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT; Página para: CTT GAC TTC AGT GGC GGC AG; Rev: AGG GAA GAC GGT TTT CAC CA; Aa Para: GTT TAG CCC TGG CCG AAG; Rev: TGA CGG GCG GTG TGT ACA AGG.

La actividad de IDO-Gal3 se evaluó en un modelo de ratón con osteoartritis postraumática30 que aplica carga mecánica cíclica a las rodillas de ratones de edad avanzada (6 meses), causando daño mecánico y la consiguiente inflamación y degradación del cartílago30,31. Los ratones fueron anestesiados y colocados en un dispositivo con la rodilla en flexión; Se aplicó carga (9 N) axialmente durante 500 ciclos y se realizaron sesiones de carga en los ratones 5 veces por semana durante el experimento. Se preparó IDO o IDO-Gal3 a 143 μM y se inyectaron intraarticularmente 20 μl de cada tratamiento al comienzo de cada semana del estudio, y cada rodilla recibió 4 tratamientos en total. Al final del estudio de 4 semanas, los ratones fueron sacrificados para analizar la expresión genética y la histopatología.

La farmacocinética de la retención de IDO e IDO-Gal3 después de la inyección local en el sitio de la enfermedad se evaluó mediante imágenes intravitales en el transcurso de 7 días. Ambas proteínas se marcaron con éster NHS Li-Cor IRDye 680RD (Li-Cor Biosciences) para visualizar y medir la retención de proteínas en la rodilla. Los ratones se sometieron a carga mecánica durante 2 semanas antes de administrar cada tratamiento mediante inyección intraarticular. Se realizaron imágenes intravitales (excitación 672 nm, emisión 694 nm) inmediatamente después de la inyección y cada 24 h posteriores. La señal de fluorescencia medida en la articulación a lo largo del tiempo se normalizó con respecto a la medición inicial para cada rodilla y se ajustó individualmente una caída exponencial para cada muestra. El AUC/biodisponibilidad para cada articulación se calculó a partir de la línea de decaimiento exponencial de mejor ajuste. Después de 7 días, los ratones fueron sacrificados y se tomó una imagen ex vivo de cada articulación sin la piel circundante para aumentar la sensibilidad de la medición.

La expresión genética se evaluó mediante TaqMan qPCR en la articulación de la rodilla y el ganglio linfático poplíteo que drena la articulación de la rodilla. Después de la eutanasia, se extirparon las rodillas y los ganglios linfáticos poplíteos. El tejido articular combinado de la pared sinovial y la superficie articular (sin exceder los 30 mg en total) y los ganglios linfáticos poplíteos se homogeneizaron con pulverización de perlas en Qiazol. El ARN se extrajo y purificó utilizando el mini kit RNeasy Plus de Qiagen y se cuantificó utilizando una placa NanoQuant de Tecan en un lector de microplacas (Tecan Infinite 500, Tecan). El ARN se convirtió en ADNc utilizando el kit iScript Synthesis de Bio-Rad (Hercules). La expresión génica se calculó mediante el método ΔΔCt, normalizando a GAPDH y beta-actina (ACTB). Los reactivos TaqMan se adquirieron de ThermoFisher y se utilizaron según los protocolos proporcionados, utilizando cebadores apropiados (IL-12β: Mm01288989_m1, IL-6: Mm01210732_g1, MMP13: Mm00439491_m1, TNF-α: Mm00443258_m1, GAPDH: Mm99999915_g1, ACTB : Mm02619580_g1).

Las muestras de tejido se fijaron en formalina al 10% y se descalcificaron en EDTA al 20% durante 7 días. Se utilizó un ciclo estándar de 8 h de alcoholes graduados, xilenos y cera de parafina para procesar los tejidos antes de incrustarlos y seccionarlos a 5 μm de espesor. Las secciones se montaron en portaobjetos de vidrio cargados positivamente y se tiñeron con H&E utilizando el tinte automático Gemini (ThermoFisher). La tinción con safranina O se realizó utilizando el kit de tinción StatLab. Se tomaron imágenes de las secciones utilizando el escáner de diapositivas Leica SCN400. Cada articulación fue evaluada mediante al menos dos secciones frontales medias para tinciones de H&E y safranina O. Un patólogo veterinario certificado realizó interpretaciones histopatológicas en condiciones de enmascaramiento38. La puntuación OARSI se basó en las mesetas tibiales medial y lateral (escala de 0 a 6)39, y al mismo tiempo se asignó una puntuación genérica en función de las características H&E y la tinción con safranina O de las mesetas tibiales de acuerdo con la metodología DJD (gravedad DJD, escala 0-3).

Se adquirieron dieciséis ratas Lewis macho (de 12 a 14 semanas de edad, aproximadamente 250 g) de Charles River Laboratories. Las ratas se aclimataron a las instalaciones de alojamiento de la Universidad de Florida durante 1 semana. Después de la aclimatación, las ratas se sometieron a pruebas iniciales de marcha y de comportamiento de von Frey. Después de las pruebas de comportamiento iniciales, todas las ratas recibieron cirugía del ligamento colateral medial más sección del menisco medial (MCLT + MMT) en la extremidad trasera derecha. Los datos de la marcha se recopilaron en las semanas 3, 5 y 7 después de la cirugía utilizando un Phantom Miro Lab320 (Phantom Camera Control 3.0), mientras que las pruebas de von Frey se realizaron semanalmente después de la cirugía. Ocho semanas después de la cirugía, las ratas recibieron una inyección unilateral de solución salina o IDO-Gal3. Las ratas se sometieron a pruebas de von Frey al día siguiente de la inyección y a pruebas de marcha 2 días después de la inyección. Tanto los datos de la marcha como los de von Frey se recogieron semanalmente hasta la eutanasia.

Se anestesiaron ratas sometidas a cirugía MCLT + MMT en una caja de sueño con isoflurano al 2,5% (Patterson Veterinary). Luego, las ratas se prepararon asépticamente con un exfoliante quirúrgico con betadine (Purdue Products) y etanol al 70 % por triplicado, y se transfirieron a un campo estéril con anestesia mantenida mediante inhalación con mascarilla de isoflurano al 2,5 %. Durante la cirugía MCLT + MMT, se realizó una incisión cutánea en la línea media de 1 a 2 cm a lo largo de las caras mediales de la rodilla de rata y se retrajo la piel para revelar el ligamento colateral medial. Se seccionó el ligamento colateral medial y se colocó la rodilla en orientación valgo para estirar el compartimento medial y exponer el menisco medial. El menisco medial se cortó radialmente y se utilizaron suturas trenzadas de vicryl absorbibles de 5-0 (Ethicon) para el cierre muscular y suturas de monofilamento de nailon de ethilon 4-0 (Ethicon) para el cierre de la piel. Las ratas se recuperaron postoperatoriamente en una caja calentadora hasta que soportaron peso en todas las extremidades. Para el tratamiento del dolor, las ratas recibieron una inyección subcutánea de buprenorfina (0,05 mg kg-1) (Patterson Veterinary) intraoperatoriamente y cada 12 h durante 48 h. Las ratas se agruparon en una cohorte de inyección de solución salina (n = 7) o una cohorte de inyección de IDO-Gal3 (n = 8). Ocho semanas después de la inducción de la OA, las ratas recibieron inyecciones unilaterales de 30 µl de solución salina estéril o IDO-Gal3 (33 pg µl−1) en la rodilla operada usando jeringas antialérgicas estériles (1 ml, 27G × 3/8) (Becton Dickinson) . En primer lugar, se anestesiaron las ratas con isoflurano al 2,5% (Patterson Veterinary) y se preparó asépticamente la rodilla operada como se describe anteriormente. Luego se insertó la aguja a través del ligamento rotuliano siguiendo el surco rotuliano hasta el espacio articular. Se flexionó la rodilla y se limpió el lugar de la inyección con una gasa estéril y etanol al 70%.

La sensibilidad táctil se evaluó midiendo el umbral de retirada de la pata del 50 % determinado mediante el método arriba-abajo de Chaplan para los filamentos de von Frey1. Antes de la cirugía, los animales se aclimataron a la jaula con piso de malla de alambre. Las ratas se sometieron a pruebas de von Frey la semana antes de la cirugía y semanalmente después de la cirugía durante 12 semanas. En la semana 8, se inyectó a las ratas y luego se les realizó la prueba de von Frey al día siguiente. Durante la prueba de von Frey, se aplicó una serie de filamentos de von Frey (0,6, 1,4, 2,0, 4,0, 6,0, 8,0, 15,0 y 26,0 g) a la región plantar de cada pata trasera. En primer lugar, se aplicó el filamento von Frey de 4,0 g. Se aplicó un filamento menos rígido si se produjo una retirada de la pata, y se aplicó un filamento más rígido si no se produjo una retirada de la pata. Utilizando estos datos, la fuerza a la que las ratas tenían la misma probabilidad de retirarse o tolerar se calculó mediante la aproximación de Chaplan1.

Se recubrieron partículas funcionalizadas con estreptavidina disponibles comercialmente (Dynabeads MyOne Streptavidin C1, 65001; Life Technologies) con anticuerpos biotinilados para CTXII (AC-08F1, ImmunoDiagnostic Systems), IL-6 y MCP1 (517703 y 505908, Biolegend). Aquí, las partículas se lavaron 3 veces en PBS, se incubaron durante 2 h en un revólver de tubo a temperatura ambiente en mezclas de anticuerpos que contenían 8,9 ng µl-1 anti-CTXII, 8,9 ng µl-1 anti-IL-6 o 357 ng µl. -1 anti-MCP1 y luego se pasó a incubación estática a 4 ° C durante la noche. Luego, las partículas se lavaron tres veces en PBS que contenía BSA al 2 % y EDTA 2 mM (tampón de captura), y las cantidades finales de anticuerpos por partícula se midieron como 0,33 ng de Ab µg-1 de partícula (anti-CTXII), 0,33 ng de Ab µg-1 de partícula. (anti-IL-6) y 13,0 ng de partícula Ab µg-1 (anti-MCP1).

Tras la eutanasia mediante desangramiento, se realizó captura magnética tanto en la rodilla operada como en la contralateral, como se describió anteriormente40. Brevemente, se suspendieron 300 µg de partículas magnéticas conjugadas con anticuerpos (partes iguales para cada tipo de partícula) en 10 µl de solución salina y luego se inyectaron en la rodilla operada y contralateral. Después de 2 h de incubación en la rodilla, las partículas se recogieron mediante 5 lavados repetidos de la rodilla con 50 µl de PBS, se combinó el líquido recogido y se aislaron las partículas del líquido mediante un separador magnético. Las partículas recolectadas se lavaron dos veces con tampón de captura y luego se incubaron durante 15 minutos en tampón Glicina-Tris 100 mM (pH 3,1) que contenía BSA al 2% y EDTA 2 mM (tampón de liberación). Después de la liberación del biomarcador, las partículas magnéticas se aislaron mediante separación magnética y el pH del sobrenadante se ajustó a 8,3 para ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA). Luego se midió CTXII en el sobrenadante usando el kit Cartilaps CTXII ELISA (AC-08F1, kit ImmunoDiagnostic Systems Cartilaps) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y CCL2 se cuantificó usando un kit ELISA CCL2 de rata (KRC1012 Life Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y descritas previamente. modificaciones41. La IL-6 se cuantificó mediante ELISA desarrollado en el laboratorio utilizando anticuerpo anti-IL-6 de rata biotina (517703) y anticuerpo anti-IL-6 de rata purificado (recubrimiento) (517701, Biolegend). El anticuerpo de recubrimiento se diluyó en NaHCO3 100 mM y Na2CO3 34 mM (pH 9,5), se colocó en micropocillos recubiertos (Nunc MaxiSorp, 434797; ThermoFisher), se incubó durante 30 minutos en un agitador de placas y luego durante la noche a 4 °C, se lavó 5 veces con PBS. con Tween-20 al 0,5% (tampón de lavado), se bloqueó durante 1 h con PBS que contenía 2% de BSA y 10% de suero bovino tratado térmicamente y finalmente se lavó 5 veces con tampón de lavado. Las muestras y los estándares se preincubaron con anticuerpo de detección anti-IL-6 (30 min a temperatura ambiente y luego durante la noche a 4 °C), luego se agregaron a la placa ELISA y se incubaron durante 3 h. Luego, la placa se lavó 5 veces y se agregaron a la placa 100 µl de avidina-HRP (405103, Biolegend, diluida 500 veces en BSA al 2% y suero bovino tratado térmicamente al 10%) y se incubó durante 30 minutos. La placa se lavó nuevamente 5 veces, agregándose 100 µl de sustrato de tetrametilbencidina durante 15 minutos, seguido de 100 µl de solución de parada (ácido sulfúrico diluido). La absorbancia se leyó a 450 y 650 nm. Las partículas se cuantificaron en 60 µl de tampón de captura, y las suspensiones de partículas se leyeron para determinar su absorbancia a 450 nm utilizando el lector de microplacas multimodo Synergy 2, como se describió anteriormente40.

Después de la captura magnética, las rodillas operadas y contralaterales se diseccionaron y se colocaron en formalina tamponada neutra al 10% (ThermoFisher) durante 48 h a temperatura ambiente. Después de la fijación, las rodillas se descalcificaron usando Cal-Ex (ThermoFisher) durante 5 días a temperatura ambiente, se deshidrataron a través de una escalera de etanol y se incluyeron en cera de parafina mediante infiltración al vacío. Luego, se adquirieron secciones frontales de 10 µm, con al menos una sección tomada cada 100 µm a través de la región de carga del menisco medial. Los portaobjetos se tiñeron con azul de toluidina.

Se adquirieron dieciséis ratas Lewis macho (de 12 a 14 semanas de edad, aproximadamente 250 g) de Charles River Laboratories. Las ratas se aclimataron a las instalaciones de alojamiento de la Universidad de Florida durante 1 semana. Luego, las ratas se sometieron a cirugía MCLT + MMT. Después de 8 semanas, las ratas recibieron una inyección de 50 µl de Nano-Glo Luciferase (NL) o Nano-Glo Luciferase Galectin-3 (NL-Gal3). Se tomaron imágenes de IVIS en las ratas inmediatamente después de la inyección, luego 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20, 24 y 28 días después de la inyección. Después de obtener imágenes el día 28, se sacrificaron las ratas y se diseccionaron las rodillas operadas y contralaterales para analizar la distribución del tejido articular mediante IVIS. Se midió la retención articular in vivo en las rodillas operadas y contralaterales de 16 ratas Lewis macho. 8 semanas después de la cirugía MCLT + MMT, las rodillas se prepararon asépticamente y las ratas recibieron inyecciones bilaterales de NL (50 µl, 3,27 µM) (n = 8) o inyecciones bilaterales de NL-Gal3 (50 µl, 3,27 µM) (n = 8 ) tanto en rodillas operadas como contralaterales. (Las cirugías e inyecciones se realizaron de la misma manera que se describe anteriormente). Se flexionaron las rodillas y luego se inyectaron 50 µl de furimazina (50 µl, dilución 1:50 en PBS). Inmediatamente después de la inyección, se flexionaron nuevamente las rodillas y se midió la luminiscencia con IVIS utilizando un tiempo de exposición de 1 s (y 60 s) en el campo de visión D. Las inyecciones de furimazina y las imágenes de IVIS se repitieron en 1, 2, 4, 8, 12, 16. , 20, 24 y 28 días después de la inyección de NL o NL-Gal3. Para el análisis, se dibujó una ROI alrededor de la señal luminiscente más grande y se copió para crear una ROI de tamaño idéntico para todas las rodillas.

Después de obtener imágenes el día 28, las ratas fueron sacrificadas mediante punción cardíaca bajo anestesia profunda con isoflurano. Se diseccionaron las rodillas para aislar el tejido rotuliano, el tejido tibial, el tejido femoral y el menisco. El tejido rotuliano incluía la rótula, la membrana sinovial rotuliana y la almohadilla grasa. El tejido tibial incluía la tibia y la membrana sinovial adjunta. El tejido femoral incluía el fémur y la membrana sinovial adjunta. Los tejidos se colocaron en placas de 24 pocillos y se incubaron con furimazina (dilución 1:50 en PBS) a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 min. Después de la incubación, se retiraron los tejidos de las placas de 24 pocillos y se midió la luminiscencia con IVIS mediante exposición automática en el campo de visión C. Para la evaluación, se dibujaron regiones de interés individuales alrededor del tejido rotuliano, el tejido tibial, el tejido femoral y el menisco. La ROI de cada tejido se copió para crear una ROI de idéntico tamaño para el tejido respectivo.

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism 8 y 9, con las siguientes excepciones. Los datos de osteoartritis inducida quirúrgicamente se analizaron utilizando R Analytics 4.0.4 con RStudio 2022, y se utilizó MATLAB 2020b para las pruebas U de Mann-Whitney sobre datos de psoriasis. Los análisis específicos del estudio se informan en los títulos de las figuras.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos principales que respaldan los resultados de este estudio están disponibles en el artículo y en su información complementaria. Los conjuntos de datos fuente están disponibles para fines de investigación a través de los autores correspondientes previa solicitud razonable.

Los códigos para el análisis de datos de la marcha están disponibles en https://github.com/OrthoBME, https://github.com/OrthoBME/GAITORsuite y https://github.com/OrthoBME/GEKO.

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Los siguientes autores contribuyeron igualmente: Evelyn Bracho-Sanchez, Fernanda G. Rocha, Sean K. Bedingfield, Brittany D. Partain y Sabrina L. Macias.

Familia J. Crayton Pruitt Departamento de Ingeniería Biomédica, Universidad de Florida, Gainesville, FL, EE. UU.

Evelyn Bracho-Sanchez, Brittany D. Partain, Sabrina L. Macias, Maigan A. Brusko, Margaret M. Fettis, Shaheen A. Farhadi, Kevin Koenders, Alexander J. Kwiatkowski, Antonietta Restuccia, Bethsymarie Soto Morales, Arun Wanchoo, Kyle D Allen, Gregory A. Hudalla y Benjamin G. Keselowski

Departamento de Biología Oral, Facultad de Odontología, Universidad de Florida, Gainesville, FL, EE. UU.

Fernanda G. Rocha & Shannon M. Cartera

Departamento de Ingeniería Biomédica, Universidad de Vanderbilt, Nashville, TN, EE. UU.

Sean K. Bedingfield y John M. Collazo

Departamento de Anatomía y Biología Celular, Facultad de Medicina, Universidad de Florida, Gainesville, FL, EE. UU.

Eric Y. Helm y Craig L. Duvall

H. Lee Moffitt Cancer Center and Research Institute, Tampa, FL, EE. UU.

Dorina Avram

División de Ciencias de la Salud Oral y Craneofacial, Facultad de Odontología Adams, Departamento de Microbiología e Inmunología, Facultad de Medicina, Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill, Chapel Hill, Carolina del Norte, EE. UU.

Cartera Shannon M.

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EB-S., FGR, BDP, SKB, SLM y AJK contribuyeron al diseño del trabajo y a la adquisición, análisis e interpretación de los datos. AR, MMF, SAF, EYH, JMC, KK, MAB, BSM y AW contribuyeron a la adquisición y análisis de datos. DA contribuyó al diseño del trabajo y al análisis e interpretación de los datos. CLD, KDA y SMW contribuyeron al diseño del trabajo y al análisis e interpretación de los datos, y revisaron sustancialmente el manuscrito. BGK y GAH concibieron y dirigieron el trabajo, contribuyeron al diseño del trabajo, contribuyeron al análisis e interpretación de los datos y escribieron el manuscrito. Todos los autores contribuyeron y aprobaron el manuscrito enviado.

Correspondencia a Gregory A. Hudalla o Benjamin G. Keselowsky.

BGK y GAH son fundadores, poseen acciones y forman parte del consejo asesor científico de Anchor Biologics, Inc. La Universidad de Florida se relaciona con las moléculas y sus usos informados en este artículo. Los demás autores no declaran tener intereses en competencia.

Nature Biomedical Engineering agradece a Ursula Grohmann, Gabriel A. Rabinovich y los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Métodos y figuras suplementarios.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Bracho-Sánchez, E., Rocha, FG, Bedingfield, SK et al. Supresión de la inflamación local mediante la indolamina 2,3-dioxigenasa anclada a galectina. Nat. Biomédica. Ing (2023). https://doi.org/10.1038/s41551-023-01025-1

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Recibido: 08 de julio de 2021

Aceptado: 16 de marzo de 2023

Publicado: 01 de mayo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41551-023-01025-1

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